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如何使用超滤管进行蛋白浓缩和更换Buffer

更新时间:2019-12-19 点击次数:11455次
  蛋白浓缩和换Buffer通常使用的超滤管,选择合适的超滤管,主要考虑MWCO和浓缩体积,通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3,若目的蛋白分子量为10kD左右,则可以用截留分子量3kD的超滤管。
  使用前加入MilliQ水,水量*过膜,冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出,即可加入蛋白液,加入的多少,以不超过管顶的白线为准。操作要轻,加入蛋白液前,超滤管需要插在冰上预冷。当浓缩到剩下1ml时,取50ul国产Bradford溶液,加入10ul流穿,看有没变蓝色,以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了,将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。要判断是否漏管,用5mg/ml的BSA离心10min,再取流穿,跑蛋白胶或Bradford粗测,继续加入剩下的蛋白液浓缩直到所有浓缩液都加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀,导致堵管。若发生沉淀,要确定沉淀的具体原因,是蛋白浓度过高还是Buffer不合适:前者可用多根超滤管同时超滤,降低浓度的办法解决,后者的方法是换不同的Buffer,直到蛋白不发生沉淀为止。
  前面几步用以浓缩蛋白,如果要换Buffer,在总蛋白液浓缩至lml左右的时候,轻轻加入新的Buffer(经0.22um超滤膜超滤),再浓缩至1ml左右,连续三次,后一
  次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定,-般不多于500u1,也有浓缩至200ul以内的情况。按照每次至少10倍左右的体积浓缩算,三次达到1000倍以上,基本上可以达到换buffer的目的。
  取出蛋白浓缩液的操作在冰上操作,用黄枪头取,轻轻顺着边缘插入枪头,轻轻吹打、混匀蛋白液,注意不要碰到超滤膜,然后吸取浓缩液,每次吸接近200ul,直到吸完。管底剩下的后一点浓缩液不必吸取,否则难度太大,有可能损坏超滤膜。后加入MilliQ水到超滤管中,没过超滤膜,防止膜失水变干。

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