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标准操作流程如下:
1. 仪器准备:
◦ 预热分光光度计或酶标仪30分钟以上,设置波长为405nm
◦ 准备离心机、移液器等必要设备
◦ 准备比色皿或96孔板
2. 试剂配制:
◦ 可能需要配制工作液,如将试剂一与试剂二按特定比例混合
◦ 配制后的试剂需2-8℃避光保存,建议一周内使用
3. 样本处理:
◦ 血清样本:室温血液自然凝固30分钟后,在4℃条件下1000×g离心15分钟,取上清液
◦ 血浆样本:将全血收集到含抗凝剂的管中(EDTA、柠檬酸钠或肝素),混合20分钟,在4℃条件下1000×g离心15分钟,取上清液
◦ 样本保存:上清液可于-20℃以下保存,但24小时内检测可放入2-8℃储存
4. 样本测定(以96孔板为例):
5. 反应与检测:
◦ 充分混匀各孔液体
◦ 37℃水浴反应30-60分钟
◦ 使用分光光度计或酶标仪在405nm波长处测定各管吸光度,分别记为A空白、A标准和A样本
6. 数据计算:
◦ 绘制标准曲线:以标准液浓度为横坐标,ΔA标准为纵坐标
◦ 计算样本钠浓度:根据A样本值在标准曲线上确定对应的钠浓度
7. 质量控制:
◦ 每次实验应设置空白对照、标准曲线和重复样本
◦ 确保空白吸光度≤0.20,空白吸光度变化率△A/min<0.08
◦ 线性范围应为0-180mmol/L(r≥0.990),批内精密度CV≤10%
试剂名称 | 空白管 | 标准管 | 样本管 |
试剂一(μL) | 200 | 200 | 200 |
试剂二(μL) | - | - | - |
标准液(μL) | - | 20 | - |
样本上清液(μL) | - | - | 20 |
蒸馏水(μL) | 20 | - | - |
β-半乳糖苷酶(μL) | 20 | 20 | 20 |
ONPG底物(μL) | 20 | 20 | 20 |